Klonazio Molekularraren Prozesua eta DNAaren Sekuentziazioa

2) Klonazio Bektorea Aukeratzea

Bektoreak: Interesatzen zaizkigun DNA zatiak garraiatzen eta zelula ostalarian txertatzen dituzten molekulak dira; gero, zelula ostalarian DNA zati horiek erreplikatuko eta espresatuko dira.

• Klonazio-bektore erabilienak hauek dira:
  • Plasmidoak: Bakterioen kromosomaz kanpoko DNA zirkularreko molekula txikiak dira.
  • Birusak (bakteriofagoak)
  • Kosmidoak: Plasmidoak bezalakoak, baina luzeagoak.
• Plasmidoak izaten dira bektore garrantzitsuenak. Ezaugarriak:
  • Tamaina erabilgarria.
  • Independienteki erreplikatzen dira.
  • Antibiotikoen aurreko erresistentzia ematen duten geneak eraman ditzakete (markadore bezala erabiltzen dira hauek).
  • Eukariotiko batzuetan ere sar daitezke (legamiak, landare zelulak).

3) rDNA Zelula Ostalarian Barneratzea

Zelula ostalaria: Interesatzen zaigun DNA zatia erreplikatuko duen zelula da.

• Prokariotoak: E. Coli normalean (erraz lortu, erraz manipulatu…).
• Eukariotoak: Zailagoa da lortzea eta mantentzea. Normalean legamiak erabiltzen dira, prokariotoen ezaugarri asko dituztelako: zelulabakarrak, errez manipulatu, etab.

Barneratzeko Metodo Ezberdinak

Liposomak: Besikula esferikoak, barruan rDNA daramatenak. Zelularen mintzarekin bat egin eta rDNA barnera askatu.

4) DNA Birkonbinatzailea Daramaten Zelula-klonak Lortzea

Klonazio-bektorea plasmidoa bada, bakterio batera trasferitu behar da. Bakterioak bereganatu, eta zelula zatitzean, erreplikatu eta zelula berriei pasatuko die, klon birkonbinantea sortuz.

Markatzaileak

Jakiteko klonazioa gertatu den ala ez erabiltzen diren geneak dira. Antibiotikoekiko erresistentzia ematen duten geneak. Bakterio horiek antibiotikoa (markatzailea) duen ingurunean jartzean hazteko gai bada, antibiotikoarekiko erresistentzia duen genea dagoela esan nahi du.

5) Proteina Birkonbinatua Ekoiztu

Zelula ostalariek gene birkonbinatua espresa dezakete eta proteina birkonbinatua ekoiztu. Adibidez: Giza-intsulina.

DNA-ren Sekuentziazioa

DNAren nukleotidoen sekuentzia zehaztea da. Metodo ezberdinak daude, baina gaur egun, erabiliena Sanger metodoa da.

Osagaiak (Sanger Metodoa)

• Sekuentziatu nahi den DNA molekula desnaturalizatu egiten da eta DNA moldea sekuentziatua izango da.
• Kate horrekiko zebadorea edo abierazlea.
• Desoxinukleotidoak 3'P (dNTP).
• DNA polimerasa.
• ddNTP (Desoxinukleotido terminalak): Ez dute 3'OH eta beraz, DNA polimerasak ezin du beste nukleotido bat gehitu. ddNTP mota bakoitza kolore fluoreszente batekin markatuta dago.

Metodoa (Sanger)

1. Sekuentziazioa 4 saio desberdinetan egiten da.
2. Saiotsu bakoitzean DNA molde molekula bat, zebadorea, dNTP lau mota, baina ddNTP mota bat erabiltzen da.
3. Saiotsu bakoitzean DNA polimerasak ddNTP bat zoriz gehituko du, eta erreakzioa gelditu egingo da.
4. Ondoren, sortutako DNA zatien elektroforesia egingo da, eta banda desberdinak agertuz.

Osagarritasuna eta Hibridazioa

Kate biko DNA desnaturalizatu egiten da. Berriro hoztean harizpiek talka egingo dute eta osagarriek helize bikoitza osatuko dute elkarren artean (birnaturalizazioa). Sekuentzien antzekotasunak baldintzatuko du birnaturalizatuko den. Jatorri desberdinetako DNA harizpiak ere elkar lotu daitezke ADN hibridoak sortuz (HIBRIDAZIOA). Hibridazio teknikak ADN eta ARN zatiak identifikatzeko eta aurkitzeko erabiltzen dira.

HIBRIDAZIOA: DNA zatiak aurkitzen

ZUNDA

Antzeman nahi dugun ADN/ARNarekin lotuko den ADN/ARN zati txikia eta osagarria da.

Nola lortu zunda?

• ARNm-tik ateratako ADN.
• ARNm bera.
• ADN zatia ezaguna bada, ADN bera (Errestrikzio entzimak erabiliz).

Zundari markatzaile bat lotu behar zaio (reporter):

• Isotopo erradiaktiboa.
• Entzima jakin bat.
• Osagai fluoreszentea.